小鼠神经生长因子受体酶联免疫吸附测定试剂盒

Mouse NGFR/TNFRSF16 ELISA Kit

英文别名:
       TNFRSF16; CD271; Gp80-LNGFR; p75(NTR); nerve growth factor receptor;NGFR

产品简介

      本试剂盒采用双抗体夹心 ELISA 法检测样品中小鼠 NGFR 的浓度。小鼠 NGFR 捕获抗体已经预包 被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的小鼠 NGFR 会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过 洗涤被除去。接着，再加入生物素标记的小鼠 NGFR 抗体后，抗小鼠 NGFR 抗体与小鼠 NGFR 结合，形成 夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物，生物素与酶复合物特异性结合， 这样酶复合物上的 HRP 就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入 显色剂，若样品中存在小鼠 NGFR，则会形成免疫复合物，其上连接的 HRP 会催化无色的显色剂氧化生成 蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读取 450 nm 处的 OD 值，小鼠 NGFR 浓 度与 OD450 值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中 OD 值，即可计算出样品中 小鼠 NGFR 的浓度。

背景介绍

      神经生长因子受体 (NGFR)，也称为 CD271、p75NTR、TNFRSF16，是一种 I 型跨膜蛋白，属于肿瘤坏 死因子受体超家族（TNF receptor superfamily）。它是一种低亲和力受体，能够结合神经营养因子家族 的成员，如神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养蛋白 3（NT-3）和神经营养蛋白 4（NT-4）。
      NGFR 在神经元的存活和凋亡中发挥双重作用。在没有神经营养因子结合时，NGFR 可以诱导细胞 凋亡；而在与神经营养因子结合时，它则增强神经元的存活。NGFR 通过激活 NF-κB 信号通路抑制细胞 凋亡，从而增加神经鞘瘤和乳腺癌细胞的存活率。在黑色素瘤细胞中，NGFR 是一种免疫抑制因子，由干 扰素γ（IFN-γ）诱导，能够下调黑色素瘤抗原的表达，从而抑制细胞毒性 T 细胞（CTL）的激活。NGFR 在神 经系统的发育和功能中起重要作用。它参与神经元的分化、突触形成和神经可塑性。NGFR 在多种疾病中 表达异常，包括阿尔茨海默病、视网膜疾病和某些癌症。在阿尔茨海默病中，NGFR 与β- 淀粉样肽的聚集 有关，影响 tau 蛋白的过度磷酸化。在视网膜疾病中，NGFR 的表达增加与视网膜色素上皮细胞（RPE）的 增殖和凋亡相关。

产品内容

操作步骤

• 样品制备

  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：

      A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
      B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
      C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用;
      D. 组织均浆/体液：离心去除沉淀即可。
      注意：①若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
      注意：②请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
      注意：③为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

  2. 稀释样品

      查阅相关文献，预估样品中待测因子的含量，从而确定适当的稀释倍数，使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同，分别采取不同的稀释方案：
      ① 待测因子含量在20~200ng/mL范围内，一般按1:100稀释，即向297μL样品稀释液中加入3μL样品；
      ② 待测因子含量在2~20ng/mL范围内，一般按1:10稀释，即向225μL样品稀释液中加入25μL样品；
      ③ 待测因子含量在31.25~2,000pg/mL范围内，一般按1:2稀释，即向100μL样品稀释液中加入100μL样品；
      ④ 待测因子含量≤31.25pg/mL，样品一般无需稀释。
      以上方案仅供参考，实验中请详细记录样品的稀释方法。

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• 检测准备工作

  3. 试剂盒自4℃冰箱取出后，请置于室温平衡20min；如从﹣20℃取出，各组分需彻底融化后再平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存；

  4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液；

  5. 重组小鼠NGFR标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备，室温操作，请严格控制在25~28℃)
      ①配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置15min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解；
      ②配制2,000pg/mL标准品：取200μL 10ng/mL的标准品加入有800μL样品稀释液的EP管中，混匀，做上标记；
      ③按下表将2,000pg/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为2,000pg/mL，将标准品稀释液作为浓度0pg/mL。)

   

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  管号	稀释液用量(μL)	复溶后标准品用量(μL)	标准品的最终浓度(pg/mL)
  A	0	1,000	2,000
  B	300	300(从A管中取)	1,000
  C	300	300(从B管中取)	500
  D	300	300(从C管中取)	250
  E	300	300(从D管中取)	125
  F	300	300(从E管中取)	62.5
  G	300	300(从F管中取)	31.25
  H	300	0	0

  注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。
  
  

  6. 准备生物素标记小鼠NGFR抗体工作液
      ①按每孔需添加100μL抗体工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL)；
      ②按1μL生物素标记小鼠NGFR抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

  7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
      ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL）；
      ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

   

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• 检测流程

  8. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃或-20℃；
      注意：① 标准品和样品建议做双复孔检测；
      注意：② 每次实验均需绘制标准曲线。

  9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；
      注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度，请将样品适当稀释后再进行检测；
      注意：② 整个加样过程不宜超过10min，否则可能会影响检测结果。

  10. 甩去酶标板内液体，无需洗板，将板倒扣在吸水纸上拍干；

  11. 加入稀释后的生物素标记小鼠NGFR抗体工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

  12. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干；
      注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

  13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30min；

  14. 洗板5次，方法同步骤12；

  15. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃反应10~25min；
      注意：① 在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属；
      注意：② 因实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

  16. 加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570)；
      注意：读取OD值建议在10min内完成。

   

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• 数据分析

  17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
      注意：① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
      注意：② 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

   

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• 标准曲线范例