使用说明

• 步骤1:

  将试剂盒各组分室温解冻，置于冰上保存，将离心机、玻璃匀浆器 4℃预冷；

• 步骤2:

  样品准备：
  组织样品 将新鲜组织样品用适量预冷的 1×PBS（货号：PS110）清洗，取 100mg 组织加入到合适大小的匀浆器中，加入 1mL 线粒体提取液 A；
  注意：请勿使用经冷冻保存的组织样品。
  细胞样品 离心 5 min（500×g，4℃）收集细胞，用适量预冷的 1×PBS 重悬细胞，取 2×10⁷ 个细胞，离心 5 min(500×g，4℃)后弃尽上清，加入 1 mL 线粒体提取液 A 重悬细胞，并转至合适大小的匀浆器中。

• 步骤3:

  向步骤1的混合溶液中加入40/60/80μL的改良型促凝剂，轻轻混匀，将混匀后的溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5cm即可；
  注意：细胞破碎程度是提取线粒体能否成功的关键，细胞破碎不足会影响线粒体的产量，细胞破碎过度则会影响 线粒体结构的完整性。建议提前做预实验探索细胞破碎条件，推荐方案如下：
  组织样品 匀浆 5~10 次左右，取匀浆悬液与台盼蓝染液混合，观察细胞破碎情况；
  细胞样品 需要间隙严密的研杵方能达到破碎效果，匀浆 5 次后，取匀浆悬液与台盼蓝染液混合，根据破碎情况适当增加匀浆次数。请勿过度匀浆！

• 步骤4:

  在 2 mL EP 管中加入 1 mL 线粒体提取液 B，沿管壁缓慢地加匀浆液使其覆盖于上层(此时出现分层现象)，立即 4℃离心 10 min(组织样品 700×g，细胞样品 600×g)。收集 1 mL 最上层分离层至 1.5 mL EP 管中；
  注意：离心后上清会分成两层，收集最上层分离层。如果分层不明显则将所有上清收集。

• 步骤5:

  将分离层溶液离心 10min(10,000×g，4℃)，弃尽上清，沉淀即为粗线粒体，用 0.5mL 线粒体洗涤液重悬；

• 步骤6:

  在预冷的 1.5 mL EP 管中分别加入 425 μL 线粒体提取液 C 和 75 μL 线粒体提取液 D（即体积比 C:D=17:3，现用 现配），充分混匀；

• 步骤7:

  将重悬的粗线粒体缓慢地加入步骤 6 中混合液的上层，立即离心 10 min（21,000×g，4℃），弃尽上清。
  注意：离心机应在 15 sec 以内达到相应转速，否则会影响分离效果。

• 步骤8:

  加入 1 mL 的线粒体洗涤液重悬沉淀，离心 5 min（16,000×g，4℃），收集沉淀，沉淀即为高纯度的线粒体；

• 步骤9:

  线粒体使用：
  ⑴向沉淀中加入 200 μL 线粒体保存液重悬，吹打混匀后，可用于完整线粒体的功能或酶活性研究；
  ⑵向沉淀中加入 100 μL 线粒体裂解液（可在裂解液中按 1:100(V/V) 加入 100× 蛋白酶抑制剂〈货号 GRF101〉） 重悬，吹打混匀后，即得到线粒体蛋白，可用于 SDS-PAGE、WB、IP、Co-IP 等后续实验。

• 步骤10:

  线粒体染色鉴定：取 5μL 用线粒体保存液重悬的线粒体，与 5μL 健那绿染液混匀后，滴加在载玻片上，盖上盖 玻片，于显微镜下观察。可观察到线粒体呈现出蓝绿色小棒状或哑铃状。