产品简介

雅酶蛋白过表达试剂盒（ZC101）基于一种高效的转染试剂，配合使用表达增强剂，可将携带目的基因 的质粒转染至真核细胞内并高效表达。本试剂盒可在极少量细胞中完成蛋白过表达情况的检测，帮助操作 者迅速判定所构建的基因在细胞系中的表达情况。

根据表达蛋白在细胞内的分布类型，本试剂盒提供了三种可作为转染阳性参照的质粒（均以 pcDNA3.1 为载体，Amp 抗性），可分别在哺乳动物细胞系中过表达胞内蛋白 GFP（32 kDa），分泌蛋白 MBP（45 kDa）和跨膜蛋白 KCNQ4（82 kDa）。三种质粒均为无内毒素质粒，浓度均为 200 ng/μL，可直 接用于细胞转染，也可作为模板进行目的基因的构建。三种质粒的蛋白基因上均含有 His/Strep/Flag/HA 四种常见的标签蛋白基因，便于操作者采用与之适配的标签抗体进行 Western Blot 检测。

此外，本试剂盒额外提供 HRP 偶联的 DYKDDDDK-tag 抗体（直标抗体），无需使用二抗，经 1:10,000 稀释后可直接用于阳性参照蛋白和含有 Flag-tag 目的蛋白的 Western Blot 检测。

产品内容

必需的额外材料

细胞培养板（贴壁细胞）；25 mL 规格细胞培养瓶（悬浮细胞）

使用说明

• 步骤1:

  按下表提前准备细胞。对于贴壁细胞（以 6 孔板为例），根据细胞的生长情况，提前一天使用胰酶消化 处理后铺板，确保转染当日细胞总数量为 1×10⁶ 个 / 孔，或者细胞长满 80% 以上区域即可；

• 
• 步骤2:

  将准备好的无内毒素质粒和转染试剂分别使用与培养细胞一致的培养基（不加血清）进行稀释，静置 5 min；

• 
• 步骤3:

  吸取转染试剂稀释液，缓慢加入质粒稀释液中，充分混匀后静置 10 min；

• 步骤4:

  将步骤 3 中的混合液缓慢地滴加在含细胞的 6 孔板或培养瓶中，轻轻摇晃均匀；
  注意：孔板应轻轻“十”字摇晃，避免旋转摇晃。

• 步骤5:

  将细胞静置培养 12~16 h 后（即过夜培养），向 6 孔板或培养瓶中加入终浓度为 6% 的 表达增强剂（6 孔板 120 μL/ 孔，摇瓶 240 μL/ 瓶），轻轻摇晃均匀；
  注意：6 孔板应轻轻“十”字摇晃，避免旋转摇晃，若所使用的细胞系对表达增强剂敏感，可降低表达增 强剂的终浓度至 3%。

• 步骤6:

  将细胞继续培养 24 h；

• 步骤7:

  按以下步骤准备样品进行 Western Blot 检测；
  ◆对于贴壁细胞中过表达的胞内 / 跨膜蛋白，可吸尽板孔中的培养基，板中加入裂解液于摇床中 4℃裂 解 5~10 min，培养基转移至 2 mL EP 管中离心收集细胞沉淀并用少量裂解液裂解，合并两次细胞 裂解液，离心 (4℃，12,000×g，3 min)，取上清与上样缓冲液（货号：LT101 或 LT103）混和；
  ◆对于悬浮细胞，可按照每 100 μL 细胞沉淀加入 50~100 μL 裂解液的比例处理样品。

•