产品参数

自备试剂

操作步骤

•    ◆

  样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
      1. 离心收集大肠杆菌(4℃，4,000×g，30min)，弃上清；
      2. 用冷平衡缓冲液重悬细胞，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)；
          注：所用试剂中不能含有EDTA、EGTA等螯合剂，DTT、巯基乙醇等还原剂，尿素、盐酸胍等变性剂。
      3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全；
      4. (可选)如果裂解物太过粘稠，可以加入RNase A(终浓度10μg/mL)和DNase I(终浓度5μg/mL)并在冰上孵育10~15min；
      5. 离心收集上清(4℃，12,000×g，20min)；
      6. SDS-PAGE分析His融合蛋白的含量及可溶性；
  

•    ◆

  磁珠预处理
      7. 将His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠颠倒数次，使其充分混匀，取所需量的磁珠悬液，转移至离心管中，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
      8. 加入与琼脂糖磁珠等体积的冷平衡缓冲液，用移液器反复吹打5~10次，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
      9. 重复步骤 8 两次；
  

•    ◆

  磁珠与目的蛋白结合
      10. 结合：将步骤5制备好的含有His融合蛋白的上清液加入预处理好的磁珠，置于翻转混合仪上孵育(常温30min，也可置于2~8℃孵育1h或者过夜)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测抗体是否存在残留)，离心管中剩余的即为目的蛋白-磁珠复合物；
      11. 漂洗：在上一步得到的目的蛋白-磁珠复合物中加入2倍琼脂糖磁珠体积的漂洗缓冲液，用移液器反复吹打5~10次，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
  

•    ◆

  洗脱
      12. 向洗涤后的目的蛋白-磁珠复合物中加入2~5倍琼脂糖磁珠体积的洗脱缓冲液，置于翻转混合仪上孵育(常温5~10min)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸取上清，收集洗脱组分，即为目的蛋白。
  

•    ◆

  磁珠保存
      13. 向使用后的琼脂糖磁珠中加入1~3倍其体积的洗脱缓冲液 ，用移液器反复吹打5次，使磁珠彻底重悬，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
      14. 向离心管中加入1~3倍琼脂糖磁珠体积去离子水，用移液器反复吹打5次，使磁珠彻底重悬，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
      15. 在琼脂糖磁珠中加入 20%乙醇，使总体积等于初始悬浮液体积，置于 4~8℃保存。

常见问题解析