产品参数

自备试剂

操作步骤

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  样本处理
  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
      A. 血清样品：若目标蛋白丰度较高，建议用结合缓冲液或1×PBS(货号：PS110)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      B. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10μL的比例加入结合缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      C. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30μL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      D. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12000×g，2min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入结合缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12000×g，10min)。
      E. 组织样品：建议使用免疫(共)沉淀裂解液(货号：PC105)进行裂解，具体操作如下：
           ⑴把组织剪切成细小的碎片；
           ⑵按照每20mg组织样本150~250μL的比例加入裂解液；
              注意：如果样本裂解不充分，可以适当提高裂解液的用量；若需要高浓度的蛋白样品，也可适当降低裂解液的用量。
           ⑶用玻璃匀浆器匀浆，直至样本充分裂解；
              注意：若组织样本非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋振荡使其裂解充分。
           ⑷充分裂解后，10,000~14,000×g离心3~5min，小心地将上清液(蛋白样品)移入新的离心管中，即可进行后续步骤。

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  磁珠预处理
      2. 用移液器轻柔吹打Protein G琼脂糖磁珠，使其充分混匀，取所25~50 µL磁珠悬液置于 1.5 mL离心管中；
      3. 加入 500 µL 结合缓冲液 或 1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置 1 min，待磁 珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
      4. 重复步骤 3 两次；；
  

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  抗体与磁珠结合
      5. 稀释：用 结合缓冲液 或 1×PBS 稀释抗体样品至终浓度为 5~50 µg/mL，置于冰上备用；
      6. 结合：将 500 µL 上步稀释好的抗体加入预处理后的磁珠中，置于翻转混合仪上孵育 ( 常温 2 h，4℃ 4~6 h 或过夜 )，接着在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，把上清液转移到新的离心管中备用 ( 上清液可用于检测抗体是否存在残留 )，离心管中剩余的即为 抗体 - 磁珠复合物；
  注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。
      7. 洗涤：在上一步得到的 抗体 - 磁珠复合物 中加入 500 µL 结合缓冲液或 1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤两次；

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  抗原与抗体-磁珠复合物结合
      8. 结合：向洗涤后的 抗体 - 磁珠复合物 中加入 500 µL 步骤 1 制备好的样品，置于翻转混合仪上孵育 ( 常温 2 h，4℃ 4~6 h 或过夜 )，接着在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清，离心管中剩余的即为 抗原 - 抗体 - 磁珠复合物；
      9. 洗涤：在上一步得到的 抗原 - 抗体 - 磁珠复合物 中加入 1 mL 洗涤缓冲液 或 1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤三次；
      10. 洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗 脱方法。
          变 性 洗 脱：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。向步骤 9 洗涤后的 抗原 - 抗体 - 磁珠复合物 中加入 60 µL 1×SDS-PAGE 上样缓冲液 ( 货号：LT101) 混合均匀，100℃加热 10 min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到 离心管侧壁上后，收集上清，进行 SDS-PAGE 检测。
          非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤 9 洗涤后的 抗原 - 抗体 - 磁珠复合物 中加入 25~50 µL 洗脱缓冲液，室温孵育 10 min； 将离心管在磁力架上静置 1 min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，并立即加入 1 µL 中和缓冲液将洗脱产物 pH 调节至中性，用于后期功能分析。