1. 制备杂交瘤细胞 (具体步骤此处从略)

• 注意：

  ① 杂交瘤细胞融合前至少 1 周复苏传代骨髓瘤细胞 SP2/0-Ag14 小鼠骨髓瘤细胞株 ( 以下简称 SP2/0)，确保无支原体污染，融合当天处于对数生长期； ② SP2/0 与 B 淋巴细胞融合后的细胞较为脆弱，须先将融合细胞置于含细胞因子及 HAT 的液体培养基中37℃、5% CO₂培养箱孵育 2~4 h，促进其恢复。

2.半固体克隆和筛选 (以 6 孔板示例)

• 注意：

  ① 杂交瘤快速筛选半固体培养基使用前须充分混匀； ② 取放细胞培养板时须动作轻缓，保持水平，避免细胞在半固体培养基中发生位移。

  用于融合后初次筛选

  各组分用量见下表：

  

  具体操作步骤如下：

  ① 计算铺板孔数及半固体培养基用量

  以融合前使用的 SP2/0 细胞总数为基准计算铺板孔数。 注意：融合前 SP2/0 细胞数仅作为确定铺板规模的计算基准，并不代表融合后实际获得的杂交瘤细胞数。 铺板孔数 = 融合前 SP2/0 细胞总数 ÷ 每孔对应的 SP2/0 细胞数（推荐按 1×10⁶ 个计算） 根据铺板孔数计算所需杂交瘤快速筛选半固体培养基体积，每孔需 3 mL。为补偿移液及分装过程中的损耗，建议额外增加 1 孔用量。半固体培养基所需体积 = ( 铺板孔数 + 1) × 3 mL 例如：融合时使用 1.3×10⁷个 SP2/0 细胞，以每孔对应 1×10⁶个 SP2/0 细胞计算，需铺板 13 孔；所需半固体培养基体积为：(13 + 1) × 3 mL = 42 mL

  ② 使用约为半固体培养基总体积 1/20 的液体培养基重悬融合后的细胞，将细胞悬液加入半固体培养基中，充分混匀；

  例如：使用 42 mL 半固体培养基时，以约 2.1 mL 液体培养基重悬融合后的细胞。

  ③ 将上步混匀后的细胞 - 半固体培养基混合物进行铺板，每孔加入 3 mL，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5 天。

  用于亚克隆筛选

  各组分用量见下表；具体操作步骤参照前述融合后初次筛选方法，将每孔接种细胞数调整为 500 个。

  

3. 克隆挑取与筛选

• ⑴ 观察细胞团的增殖状态及大致数量；

  ⑵ 准备 96 孔板，每孔加入 200 μL 液体培养基；

  ⑶ 用 10 μL 微量移液器吸取细胞团，转移至 96 孔板中，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5~10 天

  注意：不同大小的克隆株均需挑选，生长较慢、形态偏小的克隆同样可能具备优异的抗体分泌能力，而在传统多克隆混杂的增殖环境中，这类竞争性弱势克隆极易被优势克隆压制而丢失，造成优质候选株的漏检。

  ⑷ 待细胞覆盖孔底 30% 以上，即可用适当方法 (如 ELISA、流式细胞术或 Western blot) 筛选阳性克隆。