1. 准备荧光标记抗原和制备杂交瘤细胞（具体步骤此处从略）

• 注意：

  ① 荧光标记抗原需用户自备，常用488、FITC 等荧光染料标记；或在重组抗原制备时，将GFP 等荧光蛋白与目的基因融合表达；

  ② 杂交瘤细胞融合前至少1 周复苏传代骨髓瘤细胞SP2/0，确保无支原体污染，融合当天处于对数生长期；

  ③ SP2/0 与B 淋巴细胞融合后的细胞较为脆弱，须先将融合细胞置于含细胞因子及HAT 的液体培养基中，37℃、5% CO₂培养箱孵育2~4 h，促进其恢复

2.半固体克隆和筛选（以 6 孔板示例）

• 杂交瘤筛选半固体培养基使用前须充分混匀。

  用于融合后初次筛选

  根据融合时SP2/0 细胞用量计算细胞密度，按表一用量将杂交瘤筛选半固体培养基、杂交瘤细胞和荧光抗原加入6 孔板的同一个孔中，轻柔混匀，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养5 天。

  

  用于亚克隆筛选

  按表二用量将杂交瘤筛选半固体培养基、杂交瘤细胞和荧光抗原加入6 孔板的同一个孔中，轻柔混匀，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养5 天。

  
  

  注意：

  ① 若需接种多孔（共 n 孔），建议按n+1 孔计算试剂总量。在合适的器皿中（如 50 mL 离心管），将荧光抗原加入杂交瘤筛选半固体培养基，至终浓度50~100 nM，涡旋混匀，瞬时离心10 sec 除气泡，每孔分装 3 mL 至6 孔板，最后加入杂交瘤细胞轻柔混匀；

  ② 取放细胞培养板时须动作轻缓，保持水平，避免细胞及荧光信号在半固体培养基中发生位移。

3. 克隆挑取与筛选（需配备荧光体式镜）

• ⑴ 荧光显微镜下观察阳性克隆（有荧光）的增殖状态及大致数量；

  ⑵ 准备96 孔板，每孔加入200 μL 液体培养基；

  ⑶ 在荧光体式镜下，用10 μL 微量移液器吸取荧光信号阳性的细胞团（周围可见明亮荧光），转移至96 孔板中，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养2~5 天；

  ⑷ 待细胞覆盖孔底30%以上，进行后续操作：① ELISA 检测；② 重复亚克隆；③ 扩大培养（按 96 孔板→24 孔板→12 孔板→6 孔板→6 cm 平皿→10 cm 平皿→摇瓶顺序逐级扩大）

FluorScreen筛选