1. 准备荧光标记抗原和制备杂交瘤细胞 (具体步骤此处从略)

• 注意：

  ① 荧光标记抗原需用户自备，常用488、FITC 等荧光染料标记；或在重组抗原制备时，将GFP 等荧光蛋白与目的基因融合表达； ② 杂交瘤细胞融合前至少 1 周复苏传代骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14 小鼠骨髓瘤细胞株 ( 以下简称 SP2/0)，确保无支原体污染，融合当天处于对数生长期； ③ SP2/0 与B 淋巴细胞融合后的细胞较为脆弱，须先将融合细胞置于含细胞因子及HAT 的液体培养基中，37℃、5% CO₂培养箱孵育2~4 h，促进其恢复。

2.半固体克隆和筛选 (以 6 孔板示例)

• 注意：

  ① 杂交瘤快速荧光筛选半固体培养基使用前须充分混匀； ② 取放细胞培养板时须动作轻缓，保持水平，避免细胞及荧光信号在半固体培养基中发生位移。

  用于融合后初次筛选

  各组分用量见下表：

  
  

  具体操作步骤如下：

  ① 计算铺板孔数及半固体培养基用量

  以融合前使用的 SP2/0 细胞总数为基准计算铺板孔数。 注意：融合前 SP2/0 细胞数仅作为确定铺板规模的计算基准，并不代表融合后实际获得的杂交瘤细胞数。 铺板孔数 = 融合前 SP2/0 细胞总数 ÷ 每孔对应的 SP2/0 细胞数（推荐按 1×10⁶~2×10⁶ 个计算） 根据铺板孔数计算所需杂交瘤快速荧光筛选半固体培养基体积，每孔需 3 mL。为补偿移液及分装过程中的损耗，建议额外增加 1 孔用量。 半固体培养基所需体积 = ( 铺板孔数 + 1) × 3 mL 例如：融合时使用 1.3×10⁷个 SP2/0 细胞，以每孔对应 1×10⁶个 SP2/0 细胞计算，需铺板 13 孔；所需半固体培养基体积为：(13 + 1) × 3 mL = 42 mL

  ② 在合适的容器（如 50 mL 离心管）中，向杂交瘤快速荧光筛选半固体培养基中加入荧光标记抗原，使其终浓度达到 50~100 nM。涡旋混匀后，瞬时离心 10 sec，以去除气泡；

  ③ 使用约为半固体培养基总体积 1/20 的液体培养基重悬融合后的细胞，将细胞悬液加入半固体培养基中，充分混匀；

  例如：使用 42 mL 半固体培养基时，以约 2.1 mL 液体培养基重悬融合后的细胞。

  ④ 将上步混匀后的细胞 - 半固体培养基混合物进行铺板，每孔加入 3 mL，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5 天。

  用于亚克隆筛选

  各组分用量见下表；具体操作步骤参照前述融合后初次筛选方法，将每孔接种细胞数调整为 500 个。

  
  

3. 克隆挑取与筛选 (需配备荧光体视镜)

• ⑴ 荧光显微镜下观察阳性克隆 (有荧光) 的增殖状态及大致数量； ⑵ 准备96 孔板，每孔加入200 μL 液体培养基； ⑶ 在荧光体视镜下，用10 μL 微量移液器吸取荧光信号阳性的细胞团 (周围可见明亮荧光)，转移至96 孔板中，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置培养2~5 天； ⑷ 待细胞覆盖孔底30%以上，进行后续操作：① ELISA 检测；② 重复亚克隆；③ 扩大培养 (按 96 孔板→24 孔板→12 孔板→6 孔板→6 cm 平皿→10 cm 平皿→摇瓶顺序逐级扩大)。

案例1：荧光标记真核重组抗原筛选

• 抗体靶点：CD63

  细胞密度 (初筛)：1×10⁶个/孔 (6孔板)

  荧光抗原浓度：50~100nM

  结论：如图1所示，融合后初次筛选，一步筛选得到阳性单克隆细胞株。

  
  

  A

  
  

  B

  

  图1. 单克隆细胞株279-1C1和279-1E1的分离。(A)阳性克隆图像。(B)单克隆细胞株279-1C1和279-1E1培养上清的ELISA验证。

案例2：原核重组抗原筛选

• 抗体靶点：GFP

  细胞密度 (亚克隆)：500个/孔 (6孔板)

  荧光抗原浓度：50~100nM

  结论：如图2所示，亚克隆筛选得到阳性单克隆细胞株。

  
  

  A

  
  

  B

  

  图2. 单克隆细胞株mR1-001-8的分离。(A)阳性克隆图像。(B)单克隆细胞株mR1-001-8培养上清的ELISA验证。

案例3：荧光标记多肽抗原筛选

• 抗体靶点：Integrin alpha 4/CD49D

  细胞密度 (亚克隆)：500个/孔 (6孔板)

  荧光抗原浓度：50~100nM

  结论：如图3所示，亚克隆筛选得到阳性单克隆细胞株。

  
  

  A

  
  

  B

  

  图3. 单克隆细胞株162-2-1D1的分离。(A)阳性克隆图像。(B)单克隆细胞株162-2-1D1培养上清的ELISA验证。