人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4酶联免疫吸附测定试剂盒

Human CTLA-4 ELISA Kit

英文别名:    
       CTLA-4; ALPS5; CD; CD152; CELIAC3; GRD4; GSE; IDDM12; cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4

产品简介

      本试剂盒采用双抗体夹心 ELISA 法检测样品中人 CTLA-4 的浓度。人 CTLA-4 捕获抗体已经预包被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的人 CTLA-4 会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着，再加入生物素标记的人 CTLA-4 抗体后，抗人 CTLA-4 抗体与人 CTLA-4 接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物，生物素与酶复合物特异性结合，这样酶复合物上的 HRP 就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂，若样品中存在人 CTLA-4，则会形成免疫复合物，其上连接的 HRP 会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读取 450 nm 处的 OD 值，人 CTLA-4 浓度与 OD450 值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中 OD 值，即可计算出样品中人 CTLA-4 的浓度。

背景介绍

      细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, 简称 CTLA-4）又名 CD152 是激活 T 细胞表达的膜蛋白，对 T 细胞增生起负调节作用，属免疫球蛋白超家族成员，是由CTLA-4 基因编码的 T 细胞表面跨膜蛋白，其基因定位于 2 号染色体长臂 3 区 3 带（2q33），主要表达于活化的 T 淋巴细胞表面。

      CTLA-4 与 CD28 同源，但功能相反。CD28 与其配体 B7-1/2 结合后产生刺激性信号，激活 T 细胞；而 CTLA-4 高表达后会竞争性结合 B7-1/2，抑制白细胞介素（IL）-2 分泌，从而发挥负性调控作用。CTLA-4 与 B7 分子结合的亲和力比 CD28 更高，因此它可以阻止 CD28 与 B7 分子的结合，进而抑制 T细胞的激活。CTLA-4 在 Treg 细胞上持续表达，对维持其抑制功能至关重要。Treg 细胞通过 CTLA-4 与B7 分子结合，耗尽 B7 分子，从而抑制其他 T 细胞的活化。此外，CTLA-4 还能诱导抗原呈递细胞（APC）产生吲哚胺 2,3- 双加氧酶（IDO），导致色氨酸耗尽，进而抑制 T 细胞的增殖。肿瘤细胞能够激活CTLA-4，使活化的 T 细胞失去活性，从而实现肿瘤自身的免疫逃逸。

产品内容

操作步骤

• 样品制备

  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：

      A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
      B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
      C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用;
      D. 组织均浆/体液：离心去除沉淀即可。
      注意：①若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
      注意：②请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
      注意：③为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

  2. 稀释样品

      查阅相关文献，预估样品中待测因子的含量，从而确定适当的稀释倍数，使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同，分别采取不同的稀释方案：
      ① 待测因子含量在100~1,000ng/mL范围内，一般按1:100稀释，即向297μL样品稀释液中加入3μL样品；
      ② 待测因子含量在10~100ng/mL范围内，一般按1:10稀释，即向225μL样品稀释液中加入25μL样品；
      ③ 待测因子含量在0.156~10ng/mL范围内，一般按1:2稀释，即向100μL样品稀释液中加入100μL样品；
      ④ 待测因子含量≤0.156ng/mL，样品一般无需稀释。
      以上方案仅供参考，实验中请详细记录样品的稀释方法。

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• 检测准备工作

  3. 试剂盒自4℃冰箱取出后，请置于室温平衡20min；如从﹣20℃取出，各组分需彻底融化后再平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存；

  4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液；

  5. 重组人CTLA-4标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备，室温操作，请严格控制在25~28℃)
      ①配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置15min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解；
      ②按下表将10ng/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为10ng/mL，将标准品稀释液作为浓度0ng/mL。)

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  管号	稀释液用量(μL)	复溶后标准品用量(μL)	标准品的最终浓度(ng/mL)
  A	0	1,000	10
  B	300	300(从A管中取)	5
  C	300	300(从B管中取)	2.5
  D	300	300(从C管中取)	1.25
  E	300	300(从D管中取)	0.625
  F	300	300(从E管中取)	0.315
  G	300	300(从F管中取)	0.156
  H	300	0	0

  注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。
  
  

  6. 准备生物素标记人CTLA-4抗体工作液
      ①按每孔需添加100μL抗体工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL)；
      ②按1μL生物素标记人CTLA-4抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

  7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
      ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL）；
      ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

   

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• 检测流程

  8. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃或-20℃；
      注意：① 标准品和样品建议做双复孔检测；
      注意：② 每次实验均需绘制标准曲线。

  9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；
      注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度，请将样品适当稀释后再进行检测；
      注意：② 整个加样过程不宜超过10min，否则可能会影响检测结果。

  10. 甩去酶标板内液体，无需洗板，将板倒扣在吸水纸上拍干；

  11. 加入稀释后的生物素标记人CTLA-4抗体工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

  12. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干；
      注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

  13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30min；

  14. 洗板5次，方法同步骤12；

  15. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃反应10~25min；
      注意：① 在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属；
      注意：② 因实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

  16. 加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570)；
      注意：读取OD值建议在10min内完成。

   

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• 数据分析

  17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
      注意：① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
      注意：② 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

   

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• 标准曲线范例