小鼠肿瘤坏死因子受体超家族成员5酶联免疫试剂盒

Mouse CD40/TNFRSF5 ELISA Kit

英文别名:
       Mouse CD40/TNFRSF5 ELISA Kit,Mouse CD40/TNFRSF5,Mouse CD40,Mouse TNFRSF5,TNFRSF5,CD40,B cell surface antigen CD40,B cell surface antigen CD40,Bp50B cell associated molecule,CD40 antigen,CD40 molecule,TNF receptor superfamily member 5,CD40 type II isoform,CD40,CD40L receptor,CDw40,MGC9013,nerve growth factor receptor related B lymphocyte activation molecule,p50,TNFRSF5,TNFRSF5CD40 antigen (TNF receptor superfamily member 5),tumor necrosis factor receptor superfamily member 5,tumor necrosis factor receptor superfamily,member 5,Tumor necrosis factor receptor superfamily,member 5,TNFRSF5,B cell associated molecule CD40,B cell surface antigen CD40,B cell associated molecule,B cell surface antigen CD40,Bp50,CD 40,CD40 antigen (TNF receptor superfamily member 5),CD40 antigen,CD40 molecule,CD40 molecule,TNF receptor superfamily member 5,CD40 protein,CD40 type II isoform,CD40L receptor,CDw40,GP39,HIGM1,IGM,IMD3,MGC9013,Nerve growth factor receptor related B lymphocyte activation molecule,p50 antibody T BAM,TBAM,TNF receptor superfamily member 5,TNR5 HUMAN,TRAP antibody Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5,Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 precursor,Tumor necrosis factor receptor superfamily,member 5,isoform CRA a,AI326936.

产品简介

      本试剂盒采用双抗体夹心 ELISA 法检测样品中小鼠 CD40 的浓度。小鼠 CD40 捕获抗体已经预包 被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的小鼠 CD40 会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过 洗涤被除去。接着，再加入生物素标记的小鼠 CD40 抗体后，抗小鼠 CD40 抗体与小鼠 CD40 接合，形成 夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物，生物素与酶复合物特异性结 合，这样酶复合物上的 HRP 就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后 加入显色剂，若样品中存在小鼠 CD40，则会形成免疫复合物，其上连接的 HRP 会催化无色的显色剂氧 化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读取 450 nm 处的 OD 值，小鼠 CD40 浓度与 OD450 值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中 OD 值，即可计算 出样品中小鼠 CD40 的浓度。

背景介绍

      肿瘤坏死因子受体超家族成员 5(Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 5, 简称 TNFRSF5)，通常被称为 CD40，是一种在免疫系统中发挥关键作用的蛋白质。CD40 主要表达在专职性 抗原提呈细胞（如 B 细胞、树突状细胞和巨噬细胞）表面，同时也是 T 细胞表面 CD40L 分子的天然糖蛋 白受体。CD40-CD40L 信号通路的激活参与 T 淋巴细胞活化、抗体类别转换、抗原提呈细胞激活等一系 列免疫相关生物学过程。CD40 在连接固有免疫和适应性免疫方面发挥着重要作用，影响肿瘤的发生和 发展。

产品内容

操作步骤

• 样品制备

  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：

      A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
      B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
      C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用;
      D. 组织均浆/体液：离心去除沉淀即可。
      注意：①若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
      注意：②请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
      注意：③为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

  2. 稀释样品

      查阅相关文献，预估样品中待测因子的含量，从而确定适当的稀释倍数，使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同，分别采取不同的稀释方案：
      ① 待测因子含量在10~100ng/mL范围内，一般按1:100稀释，即向297μL样品稀释液中加入3μL样品；
      ② 待测因子含量在1~10ng/mL范围内，一般按1:10稀释，即向225μL样品稀释液中加入25μL样品；
      ③ 待测因子含量在15.62~1,000pg/mL范围内，一般按1:2稀释，即向100μL样品稀释液中加入100μL样品；
      ④ 待测因子含量≤15.62pg/mL，样品一般无需稀释。
      以上方案仅供参考，实验中请详细记录样品的稀释方法。

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• 检测准备工作

  3. 试剂盒自4℃冰箱取出后，请置于室温平衡20min；如从﹣20℃取出，各组分需彻底融化后再平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存；

  4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液；

  5. 重组小鼠CD40标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备，室温操作，请严格控制在25~28℃)
      ①配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置15min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解；
      ②配制1,000pg/mL标准品：取100μL 10ng/mL的标准品加入有900μL样品稀释液的EP管中，混匀，做上标记；
      ③按下表将1,000pg/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为1,000pg/mL，将标准品稀释液作为浓度0pg/mL。)

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  管号	稀释液用量(μL)	复溶后标准品用量(μL)	标准品的最终浓度(pg/mL)
  A	0	1,000	1,000
  B	300	300(从A管中取)	500
  C	300	300(从B管中取)	250
  D	300	300(从C管中取)	125
  E	300	300(从D管中取)	62.5
  F	300	300(从E管中取)	31.25
  G	300	300(从F管中取)	15.62
  H	300	0	0

  注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。
  
  

  6. 准备生物素标记小鼠CD40抗体工作液
      ①按每孔需添加100μL抗体工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL)；
      ②按1μL生物素标记小鼠CD40抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

  7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
      ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL）；
      ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

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• 检测流程

  8. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃或-20℃；
      注意：① 标准品和样品建议做双复孔检测；
      注意：② 每次实验均需绘制标准曲线。

  9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；
      注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度，请将样品适当稀释后再进行检测；
      注意：② 整个加样过程不宜超过10min，否则可能会影响检测结果。

  10. 甩去酶标板内液体，无需洗板，将板倒扣在吸水纸上拍干；

  11. 加入稀释后的生物素标记小鼠CD40抗体工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

  12. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干；
      注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

  13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30min；

  14. 洗板5次，方法同步骤12；

  15. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃反应10~25min；
      注意：① 在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属；
      注意：② 因实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

  16. 加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570)；
      注意：读取OD值建议在10min内完成。

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• 数据分析

  17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
      注意：① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
      注意：② 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

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• 标准曲线范例