人壳多糖酶3样蛋白1酶联免疫吸附测定试剂盒

Human CHI3L1/YKL-40 ELISA Kit

英文别名:
       CHI3L1; 39 kDa synovial protein; ASRT7; Cartilage glycoprotein 39; CGP39; chitinase 3 like 1 (cartilage glycoprotein 39); chitinase 3 like 1; Chitinase 3 like protein 1 precursor; chitinase; GP 39; GP39; HC gp39; HCGP 3P; HCgp39; YKL 40; YKL40; CGP-39; CH3L1_HUMAN; chitinase 3 like 1; Chitinase-3-like protein 1 hCGP-39; YKL-40; YYL 40.

产品简介

      本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样品中人CHI3L1的浓度。人CHI3L1捕获抗体已经预包被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的人CHI3L1会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着，再加入生物素标记的人CHI3L1抗体后，抗人CHI3L1抗体与人CHI3L1接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物，生物素与酶复合物特异性结合，这样酶复合物上的HRP就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂，若样品中存在人CHI3L1，则会形成免疫复合物，其上连接的HRP会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读取450nm处的OD值，人CHI3L1浓度与OD450值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中OD值，即可计算出样品中人CHI3L1的浓度

背景介绍

      壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase 3-like 1，简称 CHI3L1)也被称为 YKL-40，是一种分泌型糖蛋白， 大约40kDa大小，由人类CHI3L1基因编码。CHI3L1也被称为YKL-40，因为它的N端三个氨基酸是YKL，并且其分子量约为40kDa。CHI3L1属于糖苷水解酶18家族成员，虽然它能够结合壳多糖，但 并不具备几丁质酶的活性，这是因为在活性位点的保守序列中发生了基因突变。CHI3L1在多种细胞类型中表达，包括巨噬细胞、软骨细胞和某些类型的癌症细胞。它的确切生理功能尚未完全清楚，但已知它参与了发育和炎性疾病，如哮喘和肿瘤。CHI3L1在肿瘤患者的肿瘤微环境和血清中高水平表达，并且与多种类型肿瘤的发展阶段和结果强烈相关，因此可以作为疾病严重程度的生物标志。

      CHI3L1在肝纤维化中的作用也得到了研究，它被认为是肝纤维化的无创分期指标之一。研究表明，CHI3L1的表达水平反映了肝纤维化的程度，因此可以作为判断肝纤维化S2期的无创检测方法。此外，CHI3L1还与炎症性疾病相关，如哮喘，并且在某些神经退行性疾病和炎症性疾病中，血清CHI3L1水平会增加。CHI3L1能够与多种受体结合，诱导不同的细胞反应，其中包括RAGE、syndecan-1/αVβ3和IL-13Rα2，这些受体通过与CHI3L1结合来激活炎症体、促进凋亡、致癌和肿瘤血管生成。

产品内容

操作步骤

• 样品制备

  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：

      A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
      B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
      C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用;
      D. 组织均浆/体液：离心去除沉淀即可。
      注意：①若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
      注意：②请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
      注意：③为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

  2. 稀释样品

      查阅相关文献，预估样品中待测因子的含量，从而确定适当的稀释倍数，使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同，分别采取不同的稀释方案：
      ① 待测因子含量在40~400ng/mL范围内，一般按1:100稀释，即向297μL样品稀释液中加入3μL样品；
      ② 待测因子含量在4~40ng/mL范围内，一般按1:10稀释，即向225μL样品稀释液中加入25μL样品；
      ③ 待测因子含量在62.5~4,000pg/mL范围内，一般按1:2稀释，即向100μL样品稀释液中加入100μL样品；
      ④ 待测因子含量≤62.5pg/mL，样品一般无需稀释。
      以上方案仅供参考，实验中请详细记录样品的稀释方法。

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• 检测准备工作

  3. 试剂盒自4℃冰箱取出后，请置于室温平衡20min；如从﹣20℃取出，各组分需彻底融化后再平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存；

  4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液；

  5. 重组人CHI3L1标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备，室温操作，请严格控制在25~28℃)
      ①配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置15min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解；
      ②配制4,000pg/mL标准品：取400μL 10ng/mL的标准品加入有600μL样品稀释液的EP管中，混匀，做上标记；
      ③按下表将4,000pg/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为4,000pg/mL，将标准品稀释液作为浓度0pg/mL。)

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  管号	稀释液用量(μL)	复溶后标准品用量(μL)	标准品的最终浓度(pg/mL)
  A	0	1,000	4,000
  B	300	300(从A管中取)	2,000
  C	300	300(从B管中取)	1,000
  D	300	300(从C管中取)	500
  E	300	300(从D管中取)	250
  F	300	300(从E管中取)	125
  G	300	300(从F管中取)	62.5
  H	300	0	0

  注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。
  
  

  6. 准备生物素标记人人CHI3L1抗体工作液
      ①按每孔需添加100μL抗体工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL)；
      ②按1μL生物素标记人人CHI3L1抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

  7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
      ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL）；
      ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

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• 检测流程

  8. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃或-20℃；
      注意：① 标准品和样品建议做双复孔检测；
      注意：② 每次实验均需绘制标准曲线。

  9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；
      注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度，请将样品适当稀释后再进行检测；
      注意：② 整个加样过程不宜超过10min，否则可能会影响检测结果。

  10. 甩去酶标板内液体，无需洗板，将板倒扣在吸水纸上拍干；

  11. 加入稀释后的生物素标记人CHI3L1抗体工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

  12. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干；
      注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

  13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30min；

  14. 洗板5次，方法同步骤12；

  15. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃反应10~25min；
      注意：① 在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属；
      注意：② 因实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

  16. 加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570)；
      注意：读取OD值建议在10min内完成。

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• 数据分析

  17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
      注意：① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
      注意：② 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

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• 标准曲线范例