产品参数

操作步骤

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  凝胶预处理
  1. 用移液器轻柔吹打Anti-DYKDDDDK免疫凝胶，使其充分混悬，迅速吸取10μL混合液置于新的离心管中；
  2. 加入500μL 1×TBS缓冲液(货号：PS121)，用移液器轻柔吹打重悬Anti-DYKDDDDK免疫凝胶，5,000rpm离心30s，吸弃上清；
  3. 重复步骤2两次；
  

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  蛋白与凝胶的结合
  4. 在预处理后的凝胶中加入500μL细胞裂解液，置于翻转混合仪上孵育(常温2h，4℃过夜)；
  5. 将上述混合液5,000rpm离心30s，然后把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测DYKDDDDK标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为蛋白-凝胶复合物；
  

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  漂洗
  6. 向步骤5所得的蛋白-凝胶复合物中加入500μL 1×TBST缓冲液(货号：PS103)，用移液器轻柔吹打，重新分散凝胶，然后上下翻转使其彻底重悬。5000rpm离心30s，吸弃上清；
  7. 重复步骤6大约三次，直至漂洗后的上清液OD280小于0.05为止；
     注意：如上清液的OD280仍大于0.05，则可适当增加漂洗次数，延长漂洗时间或提高漂洗液中去垢剂的含量。

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  蛋白洗脱
        根据下游不同的应用选择相应的洗脱方法：免疫沉淀可直接进行步骤8和9；蛋白纯化则可根据后续实验，选择多肽竞争性洗脱(步骤10和11)或低pH洗脱(步骤12和13)。
  ●变性洗脱(适用于免疫沉淀)
  8. 如需直接检测目的蛋白，则在步骤7漂洗过的蛋白-凝胶复合物中加入50μL 1×蛋白上样缓冲液(货号：LT101)，煮沸5min；
  9. 取上清进行SDS-PAGE检测；
  ●Poly DYKDDDDK多肽竞争性洗脱(适用于蛋白纯化)
  10. 将5倍凝胶体积的1×TBS(含有200~1000μg/mL Poly DYKDDDDK多肽)加入步骤7的产物中，置于翻转混合仪上孵育(4℃ 2h)，为提高洗脱效率，可适当延长孵育时间；
  11. 将步骤10得到的产物进行离心(5000rpm，30s)，将含有目的蛋白的上清液转移到新的离心管中。凝胶如需重复使用，需用0.1M Glycine-HCl缓冲液(pH3.0)进行清洗后再回收；
  ●低pH洗脱(适用于蛋白纯化)
  12. 将5倍凝胶体积的0.1M Glycine-HCl缓冲液(pH3.0)加入步骤7的产物中，置于翻转混合仪上孵育洗脱5min，洗脱时间不得超过20min；
  13. 将步骤12得到的产物进行离心(5000rpm，30s)，将洗脱产物立即加入1M Tris(pH8.0)进行中和，调节pH直至中性。