产品参数

自备试剂

操作步骤

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  样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
      1. 离心收集大肠杆菌(4℃，4,000×g，30min)，弃上清；
      2. 用冷1×PBS(货号：PS110)重悬细胞, 如果需要，可加入适量的添加剂，如非离子去污剂(NP-40)或蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)；
      3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全；
      4. (可选)如果裂解物太过粘稠，可以加入RNase A(终浓度10μg/mL)和DNase I(终浓度5μg/mL)并在冰上孵育10~15min；
      5. 离心收集上清(4℃，12,000×g，20min)；
      6. SDS-PAGE分析GST融合蛋白的含量及可溶性；
  

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  磁珠预处理
           琼脂糖磁珠的使用量可根据目的蛋白产量和磁珠载量信息计算获得。例如：采用大肠杆菌表达某目的蛋白，通过预实验估算目的蛋白产量为2~5mg，则需要取5mL 10%的磁珠悬液用于目的蛋白的纯化。以下即以此为例进行详细说明
      7. 将GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠悬液，转移至离心管中，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
      8. 加入5~10mL冷1×PBS(货号：PS110)，漩涡振荡30s，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
      9. 重复步骤 8 两次；
  

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  磁珠与目的蛋白结合
      10. 结合：将步骤5制备好的含有GST融合蛋白的上清液加入预处理好的磁珠，漩涡振荡15s，置于翻转混合仪上孵育(2~8℃ 20~30min，如果需要可延长至1h)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测蛋白是否存在残留)，离心管中剩余的即为目的蛋白-磁珠复合物；
      11. 漂洗：在上一步得到的目的蛋白-磁珠复合物中加入5~10mL冷1×PBS，置于翻转混合仪上孵育(常温2min)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测蛋白是否存在残留)。再重复此步骤一次；
  

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  洗脱
      12. 向漂洗后的目的蛋白-磁珠复合物中加入2~5mL洗脱缓冲液 ，置于翻转混合仪上孵育(常温10min，可根据具体情况适当延长时间)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，收集上清到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品；
          注：洗脱液可以通过 4℃透析或者分子筛去除游离的谷胱甘肽。
  

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  磁珠保存
           GST标签蛋白纯化琼脂糖磁珠可以重复使用，但随着使用次数增多，非特异性结合的蛋白聚集往往会造成蛋白结合载量的下降，这时便需要对琼脂糖磁珠进行清洗。
      13. 向使用后的琼脂糖磁珠中加入1~3倍其体积的洗脱缓冲液，用移液器反复吹打5次，使磁珠彻底重悬，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
      14. 向离心管中加入1~3倍琼脂糖磁珠体积去离子水，用移液器反复吹打5次，使磁珠彻底重悬，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上，溶液变澄清后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
      15. 在琼脂糖磁珠中加入20%乙醇，使总体积等于初始悬浮液体积，置于4~8℃保存。

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  蛋白纯化流程的优化
      由于不同蛋白与磁珠结合性能不同，为了提高目的蛋白的回收率和纯度，可从以下方面进行优化：
      1. 延长蛋白溶液与磁珠孵育的时间；延长漂洗时间或增加漂洗次数；延长洗脱时间或增加洗脱次数；
      2. 样品及缓冲液中加入1~10mM的DTT，有助于提高部分GST融合蛋白与磁珠的结合；
      3. 在样品溶液和缓冲液中加入0.1%的Tween-20或2%的NP-40可降低非特异蛋白的吸附；
      4. 增加磁珠用量；
      5. 采用梯度浓度还原型谷胱甘肽洗脱目的蛋白。