产品参数

自备试剂

操作步骤

•    ◆

  样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
      1. 离心收集大肠杆菌(4℃，4,000×g，30min)，弃上清；
      2. 用冷1×PBS(货号：PS110)重悬细胞, 如果需要，可加入适量的添加剂，如非离子去污剂(NP-40)或蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)。
      3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体，直到样品破碎完全；
      4. (可选)如果裂解物太过粘稠，可以加入RNase A(终浓度10μg/mL)和DNase I(终浓度5μg/mL)并在冰上孵育10~15min；
      5. 离心收集上清(4℃，12,000×g，20min)；
      6. SDS-PAGE分析His融合蛋白的含量及可溶性；
  

•    ◆

  纯化重组GST融合蛋白
      7. 轻轻重悬GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶，吸取适量加入重力柱中，用10倍柱体积的冷1×PBS(货号：PS110)平衡GST琼脂糖凝胶；
      8. 将步骤5制备好的含有GST融合蛋白的上清液加入到纯化柱中，流速控制为0.5~1mL/min；
      9. 蛋白上清液全部流出纯化柱后，立刻加入1×PBS清洗纯化柱，所需量大约为柱体积的20倍或者直到流出液的A280值达到最低且稳定；
      10. 用10~15倍柱体积的现配洗脱缓冲液以0.5~1mL/min的流速洗脱，收集洗脱液。或者根据流出液A280值判断，当数值陡然上升时开始接收洗脱液，直到A280数值降至最低且稳定时，停止收集。后续可根据目的蛋白的性质和用途，4℃透析到20mM Tris-HCl，pH8.0或者1×PBS，pH7.4中，以去除游离的谷胱甘肽。
  

•    ◆

  凝胶再生及储存
          GST标签蛋白纯化琼脂糖凝胶 可以重复使用，但随着使用次数增多，非特异性结合的蛋白聚集往往会造成流速和蛋白结合载量的下降，这时便需要对琼脂糖凝胶填料进行清洗。
      11. 使用5倍纯化柱体积去离子水清洗琼脂糖凝胶填料；
      12. 使用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗；
      13. 使用5倍柱体积去离子水清洗填料；
      14. 使用3~4倍柱体积70%乙醇或2倍柱体积的1%Triton X-100清洗填料；
      15. 使用5倍柱体积去离子水清洗填料，即完成琼脂糖凝胶填料再生。
      注：填料再生后，可以立即使用，如不立即使用，需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中，置于4℃保存。

常见问题解析