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WB技术指南
免疫印迹(Western Blot)入门操作手册
发布时间:2017-04-19 作者:雅酶生物

样品处理

1.如果是新收集的细胞,须用1×PBS洗涤2次,4-20℃,1600-3000 rpm,3 min。最后一次将上清吸走。如果是冻存于-80℃的细胞,可直接取出放置在冰上备用。

2.按如下方法进行操作:

   收集的细胞或组织,加入适量RIPA裂解液[货号:PC101、PC102、PC103、PC104](在使用前数分钟内按1:100加入蛋白酶抑制剂[货号:GRF101],如需研究磷酸化蛋白需要额外加入磷酸酶抑制剂[货号:GRF102]),涡旋振荡数秒,冰上放置30 min,间或振荡,直至充分裂解,高速低温离心(4℃,12000 g,15 min),将上清液转移到无菌离心管中备用(如蛋白不能及时使用,可以冻存于-80℃保存)。

3.每孔加入蛋白液/标准品20μL。将试剂蛋白定量试剂盒 A液:B液(50:1)配比混匀后,加入200μL至每孔。37℃烘箱中孵育30分钟或室温1小时。放置到酶标仪中测浓度【single wavelength 562nm】r2大于0.99为最好结果。测好浓度的蛋白分装放于-80℃保存。

BCA蛋白定量试剂盒[货号:ZJ101]和Bradford蛋白定量试剂盒[货号:ZJ102]。使用RIPA 裂解液裂解得到的蛋白样品,可以用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。由于含有较高浓度的去垢剂,不能用Bradford法测定由本裂解液裂解得到的样品的蛋白浓度。

将BSA标准品用PBS稀释成一系列浓度梯度:

Vial

Volume of Diluent

Volume and source of BSA

Final BSA Concentration

A

0

300μL of Stock

2000μg/mL

B

125

375μL of Stock

1500μg/mL

C

325

325μL of Stock

1000μg/mL

D

175

175μL of vial B dilution

750μg/mL

E

325

325μL of vial C dilution

500μg/mL

F

325

325μL of vial E dilution

250μg/mL

G

325

325μL of vial F dilution

125μg/mL

H

400

100μL of vial G dilution

25μg/mL

I

400

0

0μg/mL=Blank



配胶

1.将测好浓度的蛋白液与上样缓冲液[货号:LT102、LT101]一起混匀后,放入100℃水浴5-6 min。离心,放置冰上,待上样。(Tips:煮过的样品可以在-20℃条件下长期保存)

2.配制PAGE胶[货号:PG110,PG111,PG112,PG113,PG114]。

6%

8%

10%

12%

15%

Water

5.4

4.7

4.1

3.4

2.4

Bis/Acryl. 30%

2.0

2.7

3.3

4.0

5.0

4×Tris.HCl/ SDS (1.5M, pH 8.8)

2.5

2.5

2.5

2.5

2.5

10% Ammonium persulfate

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

TEMED

0.008

0.008

0.008

0.008

0.008

Total volume

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

10 ml

3.按上表顺序加各溶液配制不同浓度的下层胶,混匀好,加入两块制胶玻璃板中,用异丙醇或水封平。待下层胶凝固后,将封平液倒干净,开始配制下层胶。

Water

2.87

Bis/Acryl. 30%

0.83

4×Tris.HCl/ SDS (0.5M, pH 6.8)

1.25

10% ammonim persulfate

0.05

TEMED

0.005

Total volume

5.0 ml

按顺序加各溶液,混匀好,加入两块制胶玻璃板中,不要有气泡,立即将梳子插入,凝固后将梳子拔出。

将制好的胶装入电泳槽,倒入电泳缓冲液[货号:PS105],开始上样,每个孔上样1-40 μL(根据胶的厚度以及实验要求决定上样量)。记录上样次序,点Marker [货号:WJ101,WJ102]。


电泳&转膜&封闭

1.上样结束后开始电泳,电泳时上层胶一般80V-90V,30 min;下层胶110V-120V,120 min(电泳一般采用恒压模式,电压不宜过高)。电泳结束后需要将胶放在PBST或TBST中润洗2 min,再放入转膜缓冲液[货号:PS109]中浸泡平衡。

2.将剪好的PVDF膜先在甲醇中浸泡2 min,后在ddH2O中浸泡2 min,最后在转膜缓冲液中浸泡平衡5 min。

3.垫子、膜和胶的放置:红、(+)白架子、垫子、滤纸、膜、胶、滤纸、垫子、黑架子(-)、黑。转膜条带是从-到+。

4.冰上转膜,恒流300 mA,120 min或80 mA以下过夜。转膜结束后将膜放入PBST或TBST中浸泡3-5 min,根据实验需要剪膜。

5.用5%脱脂牛奶(0.75 g奶粉[货号:PS112]+15 mL PBS[货号:PS110])或快速封闭液[货号:PS108]在室温封闭1-2 h。

6.洗膜,1×PBST[货号:PS102]或1×TBST[货号:PS103],三次,每次5-10 min。

7.加一抗孵育(稀释度根据抗体效价而定一般需要摸索最佳条件),4℃,摇床,过夜。

8.室温洗膜,1×PBST(或1×TBST),三次,每次5-10 min。

9.加二抗孵育(HRP酶标二抗[货号:LF101,LF102]或荧光二抗),室温,2 h,摇床。

10.室温洗膜,1×PBST(或1×TBST),五次,每次5-10 min。


发光鉴定

1.显色成像(ECL化学发光或荧光直接成像)。[化学发光检测试剂盒货号:SQ201、SQ101、SQ102、SQ103]

2.结果分析

记录、拍照、扫描和保存。

3.洗膜,1×PBST(或1×TBST) 5 min,三次。

4.Stripping:将显色拍照后的PVDF膜放置在stripping液[货号:PS107]中,室温摇动30 min-60 min。

5.洗膜,1×PBST(或1×TBST) 5 min,三次。

6.可重复抗体孵育步骤,在同一张膜上检测其他的蛋白表达。一般可重复检测2-3次。


更详细操作可参考 其它下载 栏目中的《Western Blot技术手册》。

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